尊龙凯时的实验原理：平头连接是一种将制备好的平头载体与经过处理的PCR产物直接进行连接的方法。在此过程中，载体可以使用EcoRV或SmaI进行平头切割。对于PCR产物，通常在22℃下用DNA聚合酶I作用30分钟进行纯化，利用该酶的3’→5’外切酶活性以及5’→3’的聚合酶活性。如果连接要求不高，PCR产物也可直接用于连接。特别是如果使用尊龙凯时的pfuDNA聚合酶或New England Biolabs公司的VentDNA聚合酶，这两种酶具有5’→3’的校对能力，生成的PCR产物已经是平头，因此无需额外处理。尽管平头连接效率通常较低，即使高质量的连接酶或反应体系中加入PEG8000也难以显著提升效率。

通常情况下，PCR产物可以直接与平端载体DNA连接，但其连接效率较低。其中，TaqDNA聚合酶具有非模板依赖的末端转移酶活性，可以在DNA链的3'末端附加一个额外的碱基，导致PCR产物形成3'突出一个碱基的DNA分子，从而降低连接效率。为提高连接效率，可以增加T4DNA连接酶的用量。对于较短的PCR产物，可以用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，使用X-gal和IPTG筛选通常可以得到充足的重组子。另一种提高克隆效率的办法是用Klenow大片段或T4DNA聚合酶去除3'末端突出碱基，将PCR产物转换为平端DNA，然后再进行平端连接克隆。

尊龙凯时实验步骤详述如下：

一、PCR反应

1. 依次混匀以下试剂：(1) H2O：35μl， (2) 10×PCR反应缓冲液：5μl， (3) 25mmol/L MgCl2：4μl， (4) 4种dNTP：4μl， (5) 上游引物（引物1）：0.5μl， (6) 下游引物（引物2）：0.5μl， (7) 模板DNA（约1ng）：0.5μl。混匀后离心5秒。

2. 将混合物在94℃下加热5分钟，随后冰冷，快速离心数秒。接着加入TaqDNA聚合酶（0.5μl约25U），混匀后稍微离心，并在反应混合物上覆盖一滴矿物油。

3. 按照反应条件，进行PCR扩增：94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，重复35轮，最后一轮结束后，保持在72℃下10分钟以确保反应产品的充分扩增。

二、电泳分析

取10μl扩增产物，使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，检查反应产物及其长度。

三、PCR产物的纯化

扩增的PCR产物可以直接用于尊龙凯时的T-Vector克隆。如果使用平末端或粘性末端连接，通常需将产物纯化。

1. 酚/氯仿法：(1) 取反应产物加100μl TE； (2) 加等体积氯仿，混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒，收集上层水相； (3) 重复二次抽提。 (4) 在水相中加300μl95％乙醇，置于-20℃冷藏30分钟进行沉淀； (5) 10000rpm离心10分钟后，去除上清液。加入1ml 70％乙醇进行洗涤，重复两次。将沉淀溶于7ml ddH2O中备用。

2. WizardPCR DNA纯化系统：该系统能够快速有效地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于基因测序、标记和克隆等实验。该系统包括50次PCR产品纯化所需的试剂和柱子。

四、载体加dT尾

1. 将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。2. 根据PCR反应的步骤，将4μl 4种dNTP更改为4μl 25mM dTTP。3. 加入1μl（5U）的TaqDNA聚合酶，72℃反应2小时。4. 采用前述的酚/氯仿抽提。5. 加入2倍体积的95％乙醇，在-20℃沉淀1小时。6. 离心后，用70％乙醇漂洗并真空抽干，最后溶解于10ml ddH2O中。

五、PCR产物与载体的粘末端连接

1. 在7ml PCR产物中加入1ml带dT尾的pUC质粒。2. 加入1ml T4DNA连接酶和1ml 10×连接缓冲液，混匀后在16℃下连接过夜。3. 取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接

1. 在50ml PCR产物中，直接加入0.5ml T4DNA聚合酶混匀。2. 37℃反应10分钟，随后在70℃灭活10分钟。3. 进行两次酚/氯仿抽提。4. 进行乙醇沉淀，沉淀用70％乙醇漂洗后真空抽干，溶于7ml ddH2O中。5. 将质粒用SmaⅠ酶切后，70℃灭活酶15分钟，取1ml（约0.1mg）加入PCR产物中，加入T4DNA连接酶1ml和连接缓冲液1ml。6. 取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

注意事项

1. PCR反应液可直接用于连接，然而，最好先纯化PCR产物，以去除可能影响连接的成分，浓缩产物。2. PCR反应需在无菌操作台进行，以避免污染。3. 吸头和离心管应高压灭菌，使用一次即弃以防交叉污染。4. 每次加试剂前应短暂离心10秒，同时打开管盖前要注意手套是否污染。5. 设置负对照，包含除模板DNA之外的所有成分。6. 纯化树脂在使用前需充分混匀。7. PCR产物中应尽量去除矿物油，以提高DNA提取的产量。