### 一、西方印迹法原理

西方印迹法的原理与Southern或Northern杂交方法相似，但它采用了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，主要检测对象为蛋白质。此方法中的“探针”是抗体，而“显色”则使用标记的二抗。经过PAGE分离后的蛋白质样品会转移到固相载体上，如硝酸纤维素薄膜。固相载体通过非共价键吸附蛋白质，同时能够保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性。使用固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应抗体进行免疫反应，随后与酶标记或同位素标记的第二抗体反应，最后通过底物显色或放射自显影来检测特定目的基因表达的蛋白成分。该技术被广泛应用于蛋白质表达水平的检测，能够实现定性和半定量分析，成为初步鉴定蛋白质最方便和通用的方法之一。

西方印迹法的显色方法主要有几种：i. 放射自显影 ii. 化学发光ECL iii. 荧光显色ECF iv. DAB呈色。当前，在实验室中，常用的显色方法是化学发光ECL和DAB。这种方法的操作简单，只需购置现成的试剂盒即可（如使用HRP标记的二抗），反应底物为过氧化物与鲁米诺，当遇到HRP后会发光，使胶片曝光，从而得到所需的条带。

### 二、操作步骤

#### (一) 配胶

1. 在开始前，确保玻璃板干净，最后用去离子水冲洗，并将接触胶的面朝下放置于干净纸巾上晾干。分离胶和浓缩胶可提前配好（除AP和TEMED外），过滤后避光存放于4℃，可保存至少1个月。使用前需取出回温到室温，以防气泡产生。配胶时，加入10%AP和TEMED，室温较低时可提高两者的浓度到《分子克隆》建议浓度。

2. 当灌入2/3的分离胶后应立即进行封胶，胶浓度在10%以下可使用0.1%的SDS封胶，超过10%则需用水饱和的异/丁醇。封胶后，待胶凝后倒掉封胶液，使用清水和去离子水冲洗干净。

3. 灌注浓缩胶后1小时拔除梳子，边加水边拔以避免气泡进入梳孔。如有需封胶清洗。

#### (二) 样品处理

1. **培养细胞(定性)**：去培养液后用温PBS冲洗2-3遍，接着加入200-300μl的1×loading buffer，100℃加热1分钟。用细胞刮下细胞后在EP管中煮沸10分钟，最后通过离心去除团块。

2. **培养细胞(定量)**：去培养液后用PBS冲洗，加入适量冰预冷的裂解液，置于冰上10-20分钟，然后收集细胞并超声处理。12,000g离心，4℃，2分钟，取上清进行定量。

3. **组织样品处理**：将组织匀浆，注意低温。以相同的方法进行离心和样品处理。

### 三、电泳与转膜

1. 上样前，清除气泡，均匀上样。根据电泳设备的要求设置初始电压及电流进行电泳，直至目的蛋白迁移一定距离。

2. 湿转和干转的转膜准备，需注意不同的方式及其配方，并根据要求进行电转。

### 四、封闭及杂交

1. 封闭膜后，以一抗进行反应，洗涤后加入二抗进行处理，之后的步骤重复洗涤。

### 五、发光鉴定

使用HRP或AP法进行显色，遵循操作流程以获得清晰的蛋白条带。

### 六、注意事项

注意增强敏感性，通过更换试剂及适时洗涤可改善条带的可见度。对于可能的非特异性条带的出现，需适时调整洗涤步骤以提高结果的可靠性。

通过有效的西方印迹实验，不仅能够显著提高对蛋白质的检测效率，还能够为生物医学研究提供有力的数据支持，特别是在探索新型生物标志物和治疗靶点方面，**尊龙凯时**坚信这一技术的广泛应用潜力。