第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量测定不同样品中基因表达量的相对值

在进行基因表达的相对定量时，内参基因的选择至关重要。为确保结果的有效性，应遵循以下原则：

1. 优先选择表达稳定且丰盈的基因作为内参基因。
2. 避免盲目采用常用内参基因，务必根据实验需求进行选择。
3. 常用的内参基因包括GAPDH、Actin及Tublin。

在添加内参基因后，进行结果计算将有助于更准确地评估目标基因的表达情况。

二、绝对定量

绝对定量方法通过标准品来测定样品中基因表达的绝对值（拷贝数）。以下是标准品的几种选择：

• A：具有明确拷贝数浓度的样品
• B：克隆质粒
• C：PCR产物
• D：cDNA（注意：用于扩增效率测定，但不适于绝对定量）

拷贝数的计算依赖于平均分子量（MW）公式：

• dsDNA = (碱基数) x (660道尔顿/碱基)
• ssDNA = (碱基数) x (330道尔顿/碱基)
• ssRNA = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)

拷贝数计算的公式为：

(6.022 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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