在2025年4月，湖南师范大学的杨荣华教授与邹振副教授团队在《Nucleic Acids Research》上发表了一篇创新性研究文章，标题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”。该研究提出了一种基于CRISPR/Cas12a的单核苷酸变异(SNV)检测平台——高能量惩罚SNV检测平台（HEPSD）。

HEPSD平台利用二元crRNA结构的设计，不仅能够激活Cas12a的切割活性，还通过非平衡杂交的方式调整并放大单核苷酸错配信号。该平台在高GC含量背景下展现出极好的SNV区分能力，包括检测在临床样本中的难以识别的摆动突变，其准确性与qPCR和二代测序（NGS）方法高度一致，达到100%的准确率，突显了其在临床分子诊断中的巨大潜力。

研究背景

单核苷酸位点变异(SNVs)是常见的遗传变异之一，和多种严重疾病如癌症、单基因疾病及传染病的发生有密切关联。传统的SNV检测方法包括TaqMan探针和ARMS-PCR等，但在面对高GC含量区域或摆动碱基对时常常效果欠佳。虽然CRISPR-Cas系统如Cas12a在核酸检测领域具有革命性影响，但仍然存在对所有单碱基错配的高特异性不足的问题。

研究结果

双核酸探针和热力学分析

研究者们设计了由两个杂交臂组成的二元探针（BPs），通过选择性杂交来区分SNVs。实验结果表明，BPs在更为广泛的温度范畴内工作，并且与突变的结合状态维持较长时间。这种特性保证了在37°C条件下BPs的最大活性保持。

非平衡杂交驱动的高能量SNV检测系统

随后，在基于BP的Cas12a系统激活性能的基础上，研究人员结合Cas12a开发了HEPSD平台。分子动力学模拟与荧光各向异性分析显示，HEPSD在目标匹配中形成稳定复合物，而在错配情况下则表现出动态不稳定性，有效地抑制了Cas12a的激活。

HEPSD对难检SNV的高效区分能力

评估结果表明，HEPSD在区分传统方法难以识别的SNV方面表现出色，特别是在高GC含量背景下，能准确识别PAM近端和远端的错配，检测限低至0.01%的突变等位基因频率。

HEPSD对临床突变的分析

研究者选择了BRAFV600E和EGFRL858R作为靶突变进行评估。结果显示，HEPSD在104例BRAFV600E和28例EGFRL858R临床样本中，敏感性和特异性均达100%，与定量PCR及NGS结果高度一致，表明其在临床分子诊断中的应用潜力。

结论与展望

本文提出的HEPSD平台通过创新性设计的二元crRNA架构，可显著放大错配碱基的能量惩罚差异，进而实现超高特异性的SNV识别。这一平台在难以检测的SNV方面表现出色，尤其在GC含量高达70%的区域依然保持优异性能，成功定义了BRAFV600E和EGFRL858R变体，并且准确率达100%。

未来，HEPSD平台不仅为癌症早期诊断与个性化治疗提供了新的工具，其设计理念也可扩展至其他CRISPR系统，进而助力基因编辑的脱靶控制。尊龙凯时将持续关注这一领域的进展，为推动生物医疗技术的发展而努力。

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参考文献：LiuQ, JiangZ, LiS, et al. Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants. Nucleic Acids Res. 2025 Apr 10; 53(7): gkaf287. doi: 10.1093/nar/gkaf287.